Articulo importante del tipo de fibras que tenemos y como actuan ?

Diferenciación histoquímica, inmunohistoquímica y electroforética de diferentes tipos de fibras musculares

Introducción y objetivos:

En esta práctica intentaremos diferenciar entre los distintos tipos de fibras que componen el músculo esquelético. Este tipo de tejido está altamente organizado, especializado en la ejecución de la actividad contractil, implicada en multitud de eventos corporales de cualquier sistema vivo.

El músculo esquelético, junto al cardiaco, forma parte del músculo estriado. Se denomina así, por el aspecto que presentan los cortes de tejido al microscopio óptico. Esto se debe a la organización sarcomérica que presenta, con las características bandas Z, I, A, H y la línea M. A diferencia que el músculo liso, que carece de esta disposición ordenada de las fibras, además de poseer otras características metabólicas y de inervación diferentes.

Esta alta organización del músculo esquelético hace pensar que todo es homogéneo, y nada más lejos de la realidad. Aún en un mismo músculo puede haber fibras con diferentes propiedades metabólicas y diferente capacidad contractil, lo que las hará responder ante un estímulo de diferente manera.

El hecho de ser estructuras extraordinariamente plásticas, hace que se pueda adaptar a sobretrabajos desarrollando estructuras para soportarlo, y a la vez, que exista atrofiamiento en caso de no utilizarlo.

El objetivo de esta práctica es poner de manifiesto esta heterogeneidad celular del músculo esquelético y la diversidad de propiedades metabólicas y contráctiles de las fibras constituyentes; analizar la presencia de proteínas marcadoras que puedan servir para identificar las fibras y comparar mediante electroforesis la composición molecular de diferentes tipos de músculo.

Fundamento teórico

Como sabemos el músculo esquelético se compone de fibras (denominadas así por su elevada relación longitud/sección). En los mamíferos, la inervación del músculo esquelético es mononeural, o lo que es lo mismo, una fibra es inervada por una neurona, pero una neurona puede inervar a varias fibras. Es cierto también, que una neurona está en contacto siempre con el mismo tipo de fibra, y por eso, podemos definir la relación neurona"fibrascomo unidad motora. Las diferentes unidades motoras que pueden componer un músculo pueden activarse de forma independiente, consiguiendo así una regulación de la intensidad de la contracción.

Estas fibras son el resultado de la fusión de células, llamadas miocitos, durante el desarrollo. Los sincitios presentan en su interior las miofibrillas, que están envainadas por el retículo citoplasmático, al que denominamosretículo sarcoplásmico. Las miofibrillas constan de sucesiones de sarcómeros unidos por el disco o banda Z, que se ve rodeado por el túbulo T. Este túbulo es una invaginación de la membrana que permite poner en contacto la membrana plasmática con el retículo sarcoplásmico. El túbulo T está en contacto, a todo lo largo de la circunferencia del sarcómero, con las cisternas terminales. Éstas son el resultado de un ensanchamiento del retículo sarcoplásmico. Esta relación entre membranas (plasmática, túbulo T y cisternas terminales) es esencial para la regulación de la contracción muscular.

El sarcómero

La organización sarcomérica es tal, que no se aleja mucho de una disposición totalmente cristalina, sobre todo en músculos que requieren una gran potencia, como los de vuelo de la mosca. La visión de bandas es el resultado de la colocación de dos tipos de proteínas esenciales:

• Actina, que forma parte esencial de los filamentos delgados.
• Miosina, que forma parte integral de los filamentos gruesos.

En un corte transversal de un sarcómero, se observa que un filamento delgado se rodea de tres gruesos, y como se muestra en la figura, uno grueso se rodea de seis delgados. La contracción se produce gracias a la conversión que realiza la cabeza globular de la miosina, de la energía de hidrólisis del ATP a energía mecánica. La contracción se debe al acortamiento de las zonas I y H, por el desplazamiento de los filamentos delgados sobre los gruesos. Es importante la polaridad de los filamentos de actina, ya que si no el desplazamiento se realizaría en sentido contrario, desplazándose la estructura sarcomérica en lo que sería elongación, no contracción.

La actividad ATPasa se localiza en la cabeza globular de la miosina, y es el motor molecular más antiguo que se conoce. El estudio de su estructura y su actividad ha permitido caracterizar otro tipo de proteínas que permiten el movimiento, no solo sobre actina, sino sobre microtúbulos, no habiéndose caracterizado ninguna que deslice filamentos intermedios.

En el sarcómero no sólo hay actina y miosina, sino que existen toda una serie de proteínas que hacen posible su funcionamiento:

Proteína	Estructura y Componentes			Localización	Función
Miosina	Formación de estructura superenrollada cada dos moléculas y posterior asociación con polaridad enfrentada. El eje de simetría se encuentra en la línea M		2 cadenas pesadas	Componente principal de los filamentos gruesos	Con un sitio de interacción con la actina y otro con función ATPasa que es la que desarrolla el esfuerzo mecánico
		Se asocian a las cabezas de las cadenas pesadas, dos por cabeza.				4 cadenas ligeras (LC1, LC2 y LC3)
Actina	Asociación de monómeros que da lugar a un filamento con estructura similar a una doble hélice			Componente principal de los filamentos delgados	Permiten el deslizamiento sobre los filamentos de miosina
Tropomiosina	Proteína con cremallera de leucina que se asocia en forma cabeza"cola			Asociada a los filamentos de actina enrollándose en los surcos que deja.	Implicada en la estabilización de los filamentos de actina y en la regulación de la contracción al tapar el sitio de unión a miosina en ausencia de Ca++
Troponina	Forman un complejo de tres proteínas	Tn"T		En la unión cabeza cola de la tropomiosina	Tn"T y Tn"I unen TN a TM mientras que Tn"C es la unidad reguladora con capacidad para 4iones Ca++. Las tres están implicadas en el cambio de lugar de TM cuando se une calcio, dejando activo el sitio de unión a la miosina
						Tn"I
						Tn"C

Proteína	Estructura y Componentes	Localización	Función
Titina o Conectina	Proteína muy larga y flexible	Entre la línea M y el disco Z	Permite unir la miosina a los discos Z (a pesar de la contracción, pues es flexible). Además de mantenerla paralela a los filamentos de actina
Nebulina	Proteína flexible pero inextensible	Unida al disco Z	Orienta la polaridad de los filamentos de actina además de unirlos al disco Z y mantenerlos paralelos
"actinina	Formada por dos cadenas	En el disco Z	Unión de la actina en la zona del disco Z. En músculo liso hace las funciones del disco Z junto a la vinculina
Miomesina		En la línea M	Mantiene el eje de simetría de la asociación de la miosina en la línea M
Proteína C		A ambos lados de la línea M	Unida a la miosina
Cap"Z		En el disco Z	Unión de l polo + de la actina al disco Z y evita que polimericen más monómeros de actina
Tropomodulina		En el extremo " de los filamentos de actina	Evita la despolimerización de los filamentos de actina

Regulación de la contracción en el músculo esquelético

El movimiento de contracción del sarcómero se explica gracias a modelos de interacción entre la miosina y la actina. Todo comienza cuando la miosina, unida a la actina, une ATP. En ese momento se despega de la actina cambiando su conformación durante la hidrólisis del ATP. Al finalizar el proceso de hidrólisis, la miosina (con ADP + Pi en el sitio de unión a ATP), ha estirado el cuello, fijándose a otra subunidad de actina, de la cual no se despegará. Al salir del ADP + Pi, la conformación de la cabeza de miosina cambia de nuevo al estado original. Como no se ha soltado de la actina, hace que el filamento se desplace.

El método de movimiento es esencialmente igual para toda la familia de las miosinas, lo único que cambia es la cola que bien puede ser larga y estar unida a otra en un sarcómero, o corta asociada a otra corta o corta y suelta.

Este movimiento se puede producir in vitro, únicamente hace falta la actina, la miosina el calcio y el ATP. Sin embargo, in vivo, las cosas necesitan regularse, y en este caso muy finamente. Es el calcio el principal regulador de la actividad muscular, algo lógico, ya que manejar la otra variable, el ATP no es lógica, recordemos que tenemos que hacer caso a estímulos rápidos. La regulación se resume en esta figura.

• Etapa de despolarización. Se manda un mensaje vía neuronal, como onda de despolarización. La onda pasa por el túbulo T al ser este un continuo de la membrana. A ese estímulo responde un canal sensible a despolarización, ubicado en la membrana del túbulo, pero orientado hacia la cisterna terminal, iniciando la segunda etapa. En cuanto al sarcómero hay que destacar que la miosina no está unida a la actina ya que la TM se dice que está en off porque obstruye el sitio de unión de la miosina.
• Etapa de salida de Calcio. La despolarización ha llegado al canal que libera al sarcoplasma la concentración de 10 mM que tiene este ion en la cisterna terminal (no en forma libre, sino unido a una proteína llamada calsecuestrina). El calcio llega a la Tn"C, capaz de unir 4 iones, y hace cambiar la disposición de las dobles hélices de TM sobre la actina, dejando libres los sitios de unión de la miosina.
• Etapa de captura de calcio. Una vez recuperada la polaridad, se cierra el canal y comienza a funcionar una bomba Ca++"ATPasa, la cual introduce dos cationes por molécula de ATP gastada. Al disminuir la concentración de calcio en el sarcómero, se vuelve a la configuración inicial, no pudiendo la miosina unirse a la actina.

Este tipo de regulación no es válida para músculo liso, con una contracción más lenta, ya que en este no hay TN, sustituyéndolo por calmodulina, las bombas de calcio son isoformas más lentas y, además, no presenta estructuras de membrana tan especializadas.

Fibras rápidas y lentas

En la actualidad, la puesta a punto de nuevas técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas, han permitido corroborar lo que se había observado por técnicas de microscopía o electroforéticas. Esto es: las fibras de los músculos esqueléticos de vertebrados son heterogéneas en su velocidad de contracción.

El desarrollo de variedad de fibrillas de músculo esquelético responde a una tendencia evolutiva que se ha tratado de resolver de diferentes formas según avanzaba el tiempo. Se trata, por tanto, de poder responder a dos exigencias básicas:

Estímulos potentes de forma rápida.

Estímulos menos potentes pero que se alargan en el tiempo.

En definitiva, la velocidad de reacción frente a la resistencia ante un ejercicio físico. Ambas son necesarias para la supervivencia de un individuo. En el hombre, como buen generalista no posee ningún músculo que esté mayoritariamente formado por un solo tipo de fibras. El resultado en un corte transversal de un músculo, es un mosaico de fibras rápidas y lentas. Sin embargo, si hay mamíferos que poseen músculos compuestos casi en su totalidad de fibras de un solo tipo.

Nosotros, en estas prácticas vamos a utilizar como modelo de músculo preferentemente lento el músculo soleo. Procede grupo extensor del tobillo de la extremidad posterior, y se asocia con dos músculos más. El soleo tiene actividad en el mantenimiento de la postura sufriendo un ligero aumento durante la locomoción. Como modelo de músculo rápido utilizaremos el músculo extensor de los dedos largos (EDL), de roedor. El músculo debe responder a estímulos rápidos en un tiempo mínimo, aunque se agote enseguida la energía.

Las diferencias entre los distintos tipos de fibras son, tanto metabólicas, como fisiológicas. Ambas, en su conjunto proporcionan a cada una las características necesarias para realizar bien su función.

Las fibras rápidas necesitarán una inervación rápida y un método de obtención de energía igualmente rápido. Para conseguirlo, se fabrican isoformas de las proteínas descritas anteriormente o proteínas nuevas (como la cadena ligera de miosina LC3, sólo presente en este tipo de fibras). Además, se ve potenciada la vía de obtención de energía más rápida que poseemos, la glucolisis. Con esto se consigue un menor rendimiento de la glucosa y un rápido agotamiento de los recursos, lo que conlleva inexorablemente a la fatiga de la fibra en un corto periodo de tiempo. La glucolisis no requiere oxígeno, de modo que, ¿porque gastar energía en fabricar mioglobina y capilarizar en exceso la fibra?. Ya que no se van poder alargar las contracciones con el tiempo, habrá que agrandar la sección de la fibra para que la contracción sea más eficaz y violenta.

Las fibras lentas necesitarán de isoformas más lentas, ya que una contracción demasiado rápida llevaría a agotar las energías, al igual que sucedía en las fibras rápidas. El poder alargar los periodos de contracción da como posibilidad la utilización de una vía de obtención de energía mucho más lenta pero mucho más eficaz, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Esta ruta metabólica requiere oxígeno y no mucha glucosa, de modo, que no hace falta mucho almidón (al contrario que en las fibras rápidas), pero si que hay que fabricar mioglobina y hacer que llegue suficiente oxígeno capilarizando la zona. Evidentemente, si necesitamos el ciclo de respiratorio, tendremos muchas mitocondrias. Los citocromos respiratorios junto a una mayor irrigación de las fibras, hacen que a simple vista podamos diferenciar los dos tipos de fibras, ya que las oxidativas tendrán un tono más rojizo que las rápidas, carentes de componentes de color rojo.

Los diferentes rendimientos de las rutas glucolítica y oxidativa se pone de manifiesto en esta tabla.

		Tasa relativa	Glucosa utilizada	Lactato producido	¿O2 necesario?
Metabolismo Oxidativo		36"38 ATP	1	0	Si
Metabolismo Glucolítico		64 ATP	32	64	No
Las vías glucolíticas producen menos ATP por glucosa que las oxidativas, pero pueden estar activas con una tasa de producción de ATP más elevada.

Estos serían los dos extremos, ya que entre medias existen una gran variedad de fibras más o menos rápidas, más o menos oxidativas. Para repasar todo esto realizamos la siguiente tabla.

Propiedades fisiológicas y bioquímicas de los tipos de fibras de los músculos de mamíferos
Clasificación Bioquímica	RG Rápidas glucolíticas	ROG Rápidas oxidativas"glucolíticas	LO Lentas oxidativas
Clasificación fisiológica	RF Fatigables rápida	RR Rápidas resistentes a fatiga	L Lentas
Velocidad de contracción	Rápida	Rápida	Lenta
Actividad ATPasa de la miosina	Alta	Alta	Baja
Fuente de producción de ATP	Glucolisis	Oxidativa o mezcla	Oxidativa
Contenido de mioglobina	Bajo	"	Alto
Mitocondrias	Pocas	Muchas	Muchas
Capilares	Pocos	"	Muchos
Contenido de glucógeno	Alto	Intermedio	Bajo
Tasa de fatiga	Rápida	Intermedia	Lenta
Diámetro de la fibra + cantidad de tensión	Grande	Intermedio	Pequeño

Al principio del apartado, comentamos que la evolución había desarrollado, a lo largo del tiempo, soluciones alternativas más o menos similares, pero siempre orientadas a poder responder a los dos tipos de estímulos.

En peces, los músculos del miotomo (tronco corporal) están divididos en regiones separadas de músculos rojos lentos y blancos rápidos. Las fibras musculares de estas regiones tienen muchas semejanzas histológicas, bioquímica y fisiológicas con las fibras de mamífero LO y RG respectivamente. El músculo lento nunca excede del 25% de todo el miotomo. Esto es debido a que solamente se usa el músculo lento en la natación lenta o moderada. El músculo rápido se utiliza en periodos cortos de tiempo ya que se fatiga muy rápidamente. Además de las diferencias que comparten con los mamíferos, ancho de fibra y capilarización, presentan una diferencia más, y es el tipo de inervación, que se efectúa por una neurona en un extremo de la fibra rápida, mientras que una neurona de unidad motora lenta inerva en varios puntos a una misma fibra.

En artrópodos, se manifiesta una distribución similar entre fibras rápidas y lentas. Aunque las bases metabólicas de esta distinción aún no están claras. Si que parece existir una correlación con el tamaño del sarcómero y la cantidad relativa entre filamentos gruesos y delgados. De esta forma, las fibras de contracción rápida presentan sarcómeros más cortos (1,5"3 m) y una proporción relativamente baja de filamentos delgados. Sin embargo, las fibras de contracción rápida presentan sarcómeros más largos (6"15 m) y una proporción elevada de filamentos gruesos.

Las fibras suelen estar en forma de mosaico en los músculos del animal, pero si hay músculos preferentemente especializados, como los que se hallan en la cola del cangrejo de río o la langosta. Estos músculos presentan sarcómeros cortos, lo que implica contracción rápida, asociada a coletazos casi espasmódicos que permiten al animal huir rápidamente.

En otros casos estudiados, tanto en vertebrados como en invertebrados, la especialización en músculos rápidos y lentos es menos completa que en los ejemplos descritos, teniendo la mayoría distribuciones mixtas de fibras en los músculos. Ya sea que los tipos de fibras están dispuestos en músculos separados, o mezclados, la especialización de los distintos tipos de fibras es una característica funcional importante del músculo.

Métodos de obtención de datos

Una vez conocidos los principios fisiológicos y bioquímicos que diferencian los distintos tipos de fibras, describiremos en que se basan las pruebas histoquímicas, inmunohistoquímicas y electroforéticas que vamos a utilizar en estas prácticas.

Pruebas histoquímicas

Basadas en la formación de precipitados coloreados, visibles a simple vista, y de forma más específica mediante el microscopio óptico. En nuestro caso, el precipitado se forma a partir de un derivado insoluble del azul de paranitrotetrazolio (NBT), el azul de formazán. Este se forma debido a la reducción sufrida por el NBT al aumentar la concentración de NADH + H+. En ambas rutas de obtención de ATP que tienen lugar en las fibras rápidas y lentas, se forma NADH + H+ y, por tanto, es lo que acompaña al NBT lo que nos diferenciará entre las deshidrogenasas de uno u otro ciclo metabólico.

Menadiona" "glicerofosfato deshidrogenasa ( "GPD): Nos permitirá valorar la actividad deshidrogenasa de la GPD de la vía glucolítica. Dará positivo, de forma significativa en las fibras rápidas, con una tasa metabólica glucolítica muy alta.

NADH"tetrazolio reductasa (NADH"TR): Nos permite valorar la actividad deshidrogenasa de la vía respiratoria de los ácidos tricarboxílicos.

Pruebas inmunohistoquímicas

Con este tipo de pruebas, podemos diferenciar los diferentes tipos de fibras, ya que presentan distintos patrones de expresión de las proteínas componentes de la maquinaria contractil. Estos distintos patrones pueden llegar expresar una proteína en un tipo de fibra y no en el otro. La base de la detección es la misma que la que se utiliza en la inmunodetección de los Western"blot, la formación del complejo peroxidasa"antiperoxidasa y la formación de un precipitado visible al añadir los sustratos adecuados.

Por supuesto, utilizamos anticuerpos contra aquellas proteínas que se encuentran únicamente o de forma preferente en un tipo de fibras. Mediante inmunohistoquímica cuantitativa, podemos obtener las cantidades relativas de cualquier proteína para que tengamos un anticuerpo.

Uno de los epitopos más utilizados es la cadena pesada de la miosina, con diferentes isoformas que se expresan de forma diferencial en los diferentes tipos de fibras. Además de las isoformas embrionaria y neonatal, existen cuatro isoformas que se expresan en el músculo esquelético adulto, codificadas, codificadas por otros tantos genes: MHC lenta y MHC rápidas de tipo 2A, 2B y 2X. Hay anticuerpos monoclonales comerciales que reconocen específicamente la miosina lentas (tipo I) y la de fibras rápidas (IIa y IIb) sin dar reacción cruzada con las otras. La troponina T es otra proteína que presenta isoformas y para la que también tenemos un anticuerpo monoclonal para la isoforma rápida. Aún no perteneciendo a la maquinaria contractil, hay proteínas que se expresan de forma diferencial en uno u otro tipo de fibra. Este es el caso de la proteína de estrés o de choque térmico HSP72, mucho más abundante en fibras tipo I que en las de tipo II. Estos antígenos permiten obtener una información preliminar rápida sobre la naturaleza de las fibras que componen el músculo.

	Fibras tipo I Lentas	Fibras tipo II Rápidas
Miosina lenta	+
Troponina T		+
Miosina rápida		+
HSP72	+

Actividad diferencial ATPasa de la miosina